Применение аутологичных клеток пуповинной крови у новорожденных с гипоксически-ишемической энцефалопатией

   Гипоксия-ишемия головного мозга является основной причиной перинатальных неврологических повреждений. Несмотря на высокий уровень медицинской помощи в акушерстве, неонатологии и значительные успехи в профилактике осложнений родов, умеренная и тяжелая гипоксически-ишемическая энцефалопатия (ГИЭ) у новорожденных детей по-прежнему встречается с частотой 1–2 на 1000 родившихся. До недавнего времени стратегия ведения таких пациентов заключалась в поддерживающей терапии дисфункции органов. В течение последних трех десятилетий активные исследования на животных, а впоследствии и людях убедительно продемонстрировали, что индуцированная системная гипотермия (поддержание температуры тела ребенка с 6 часов после рождения в течение 72 часов на уровне 33,5°С) эффективно улучшает неврологическую картину у детей с ГИЭ. С 2010 года такая терапия стала стандартом лечения ГИЭ [1, 2, 3]. К сожалению, даже после применения индуцированной гипотермии у значительной части младенцев с ГИЭ все еще остаются неврологические расстройства различной степени тяжести, диагностируемые в течение двух лет жизни [4]. Поэтому продолжаются поиски других подходов, которые могут способствовать улучшению результатов лечения таких пациентов.

Стволовые клетки при неврологических заболеваниях

   Интерес к заместительной клеточной терапии при неврологических заболеваниях имеет долгую историю. Еще сорок лет назад было проведено много исследований по нейротрансплантации на животных [5]. Другие менее исследованные стратегии нейрорегенерации предусматривают стимуляцию эндогенных нейральных стволовых клеток. Многообещающими оказались результаты двух двойных слепых рандомизированных контролируемых клинических испытаний по трансплантации эмбриональных стволовых клеток при болезни Паркинсона, хотя первоначальные цели терапии достигнуты не были [6, 7]. Обнадеживающим в этих исследованиях стал тот факт, что имплантированные клетки эмбрионального происхождения успешно прижились и образовывали отростки. Тем не менее перенесение результатов исследований на уровень рутинной терапии пока еще вызывает значительные проблемы.

   Другим важным моментом при использовании фетальных тканей, наряду с клинической эффективностью, являются вопросы медицинской этики. Обойти спорные политические и юридические препятствия можно, обратившись к альтернативным источникам стволовых клеток. Это ксеногенные фетальные клетки, иммортализованные клеточные линии, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, стромальные стволовые клетки из жировой ткани, стволовые клетки плаценты и пупочного канатика, клетки пуповинной крови и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки [8].

Клетки пуповинной крови

   Пуповинная кровь богата стволовыми клетками, в том числе мезенхимальными. Впервые, несмотря на первоначальный скептицизм, успешная трансплантация клеток пуповинной крови человека была проведена в 1988 году для лечения ребенка с анемией Фанкони. Сегодня это уже общепризнанный метод лечения многих видов рака крови и генетических гематологических заболеваний. По приблизительным оценкам, к 2015 году ежегодно во всем мире будет проводиться 10 000 трансплантаций пуповинной крови с использованием сохраненных ранее клеток.

   У пуповинной крови, как источника плюрипотентных стволовых клеток, имеется много очевидных преимуществ. Обычно такая кровь после рождения ребенка уничтожается, как биологические отходы, в то время как ее можно легко собрать, а сама процедура забора безопасна для донора. Благодаря низкой иммуногенности клеточные трансплантаты из пуповинной крови более толерантны относительно несоответствия по HLA и, таким образом, имеют более низкий уровень реакции «трансплантат против хозяина» по сравнению со стволовыми клетками костного мозга.

   В моделях на животных с индуцированным инсультом инфузии клеток пуповинной крови человека продемонстрировали некоторые важные свойства: введенные клетки мигрируют к очагу повреждения, уменьшают размер зоны инфаркта, а также приводят к функциональному улучшению неврологических функций животных [9, 10, 11]. Также было показано, что введенные внутривенно клетки пуповинной крови пациентам с болезнью Краббе пересекли гематоэнцефалический барьер и прижились в тканях головного мозга реципиентов [D. Kurtzberg, личное общение].

Возможные механизмы позитивных неврологических эффектов введения стволовых клеток

   Вопреки общепринятой логике пересаженные клетки, вероятно, реализуют позитивные эффекты главным образом за счет размножения, дифференцировки и замены утраченных вследствие болезни нейронов [12]. Одним из возможных механизмов является паракринное влияние через секрецию нейротрофических факторов, которые помогают стимулировать размножение эндогенных нейральных предшественников [13, 14]. Клетки пуповинной крови способны защитить нейроны коры головного мозга от глутамат-индуцированного апоптоза за счет активации сигнального пути протеинкиназы В [15]. Это особенно актуально для терапии гипоксически-ишемической энцефалопатии, так как в основе успешного лечения таких детей лежит предотвращение отсроченной гибели клеток после острого гипоксически-ишемического инсульта. Клетки пуповинной крови также улучшают выживаемость олигодендроцитов за счет изменения экспрессии генов [16].

   На модели травмы спинного мозга у крыс трансплантированные мультипотентные стволовые клетки улучшали неврологическую функцию, возможно, продуцируя нейротрофические, ангиогенные и противовоспалительные цитокины, которые уменьшают вторичное повреждение [17]. В экспериментах in vitro продемонстрирована способность мононуклеарных клеток пуповинной крови секретировать интерлейкины, факторы роста и белки хемотаксиса [18].

Пилотные исследования трансплантации клеток аутологичной пуповинной крови для лечения новорожденных с гипоксически-ишемическим повреждением головного мозга

   Весьма перспективной является ранняя клеточная терапия гипоксически-ишемического повреждения головного мозга у новорожденных на 1–6 сутки рождения. Это связано с тем, что доступность аутологичной пуповинной крови после рождения ребенка позволяет провести инфузию стволовых клеток сразу же после повреждения головного мозга, особенно в фазу реперфузии. Кроме того, в этом случае не возникает никаких проблем несовместимости с HLA. А жизнеспособность ядросодержащих клеток свежей пуповинной крови выше, чем криоконсервированных единиц.

   Подобные пилотные исследования безопасности и возможностей клеточной терапии были проведены в Сингапуре в сотрудничестве с Cotton et al. (Университет Дьюка) как инициаторами клинического испытания аутологичных клеток пуповинной крови у новорожденных с ГИЭ [19, 20]. В течение двух лет детям с ГИЭ, нуждающимся в терапевтической гипотермии, проводилась трансфузия аутологичной пуповинной крови. Для получения фракции ядросодержащих клеток собранная единица пуповинной крови была уменьшена в объеме и лишена эритроцитов. Фракция ядросодержащих клеток не замораживалась и была разделена на четыре образца по 5 мл каждый. Каждый образец вводили на 12, 24, 48 и 72-й часы жизни ребенка. Мы показали, что после обработки некриоконсервированной фракции ядросодержащих клеток пуповинной крови их жизнеспособность через 96 часов составляла 91,3 % (фракция CD34⁺ клеток – 93,3 %).

   В исследовании участвовали двое детей с ГИЭ ІІ стадии (по Sarnat), судорогами, и прогнозом развития ДЦП. Аутологичная пуповинная кровь была введена в соответствии со схемой: 6 и 156 млн клеток/кг для каждого ребенка. Никаких побочных реакций, связанных с трансфузией, выявлено не было. У обоих новорожденных на магнитно-резонансных томограммах присутствовали начальные изменения в головном мозге, но при следующем исследовании в возрасте 4–6 месяцев жизни они отсутствовали. В первом случае ребенок в возрасте одного года развивается нормально. Во втором – у ребенка остается значительная задержка моторного развития с некоторым когнитивным дефицитом.

   Для оценки клинической эффективности такого лечения необходимы дальнейшие исследования. Проблемами, с которым столкнутся исследователи, могут стать этические вопросы привлечения плацебо-контролируемых групп, а также возможные трудности сбора достаточного количества пуповинной крови, особенно если требуется предварительное информированное согласие родителей. Кроме того, для получения фракции стволовых клеток пуповинной крови надлежащего качества и своевременного их введения аккредитованные банки пуповинной крови должны располагаться в непосредственной близости от роддомов, то есть на расстоянии 1–2 часов от родильного дома.

Литература

1. Gunn A., еt al. Dramatic neuronal rescue with prolonged selective head cooling after ischemia in fetal lambs// J. Clin. Invest. – 1997. – 99. № 2. – P. 248.
2. Edwards A., et al. Neurological outcomes at 18 months of age after moderate hypothermia for perinatal hypoxic ischaemic encephalopathy: synthesis and metaanalysis of trial data // BMJ: British Medical Journal. – 2010. – 340. – P. 363
3. Perlman J., еt al. Neonatal resuscitation: 2010 international consensus on cardiopulmonary resuscitation and emergency cardiovascular care science with treatment recommendations // Pediatrics. – 2010. – 126, № 5. – P. 1319–1344.
4. Jacobs S., et al. Whole-body hypothermia 1pr term and near-term newborns with hypoxic-ischemic encephalopathy: a randomized controlled trial // Arch. Pediat. Adol. Med. – 2011. – 165, № 8. – P. 692.
5. Das G., Altman J. Transplanted precursor: of nerve cells: their fate in the cerebellums of young rats // Science. – 1971. – 173, № 3997. – P. 637–638.
6. Freed C., et al. Transplantation of embryonic dopamine neurons for severe Parkinson's disease // New Engl. J. Med. – 2001. – 344, N 10. – P. 710–719.
7. Olanow C., еt al. A double-blind controlled trial of bilateral fetal nigral transplantation in Parkinson's disease // Ann. Neurol. – 2003. – 54, № 3. – P. 403–414.
8. Trounson A., et al. Clinical trials for stem сell therapies // BMC Med. – 2011. – 9, № 1. – P. 52.
9. Chen J., et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats // Stroke. – 2001. – 32, № 11. – P. 2682–2688.
10. Meier C., et al. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells // Pediat. Res. – 2006. – 59, N 2. – P. 244–249.
11. Pimentel-Coelho P., et al. Human cord blood transplantation in a neonatal rat model of hypoxic-ischemic brain damage: functional outcome related to neuroprotection in the striatum // Stem Cells Dev. – 2010. – 19, № 3. – P. 351–358.
12. Snyder E., et al. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex // Proc. Nat. Acad. Sci. – 1997. – 94, № 21. – P. 11663–11668.
13. Qurednic J., et al. Neural stem cells display an inherent mechanism for rescuing dysfunctional neurons // Nat. biotechnol. – 2002. – 20, № 11. – P. 1103–1110.
14. Ben-Shaanan T., Ben-Hur T., Yanai J. Transplantation of neural progenitors enhances production of endogenous cells in the impaired brain // Mol. Psychiatr. – 2007. – 13, № 2. – P. 222–231.
15. Dasari V., et al. Neuroprotection by cord blood stem cells against glutamate-induced apoptosis is mediated by Akt pathway // Neurobiology of disease. – 2008. – 32, № 3. – P. 486–498.
16. Rowe D., et al. Cord blood administration induces oligodendrocyte survival through alterations in gene expression // Brain res. – 2010. – 1366. – P. 172–188.
17. Chua S., et al. The effect of umbilical cord blood cells on outcomes after experimental traumatic spinal cord injury // Spine. – 2010. – 35, № 16. – P. 1520–1526.
18. Neuhoff S., et al. Proliferation, differentiation, and cytokine secretion of human umbilical cord blood-derived mononuclear cells in vitro // Exp. Hematol. – 2007. – 35, № 7. – P. 1119–1131.
19. Liao Y., et al. Rescuing the neonatal brain from hypoxic injury with autologous cord blood // Bone Marrow Transplantation. – 2013. – 48, № 7. – P. 890–900.
20. 20. National University Hospital, Singapore. Autologous cord blood cells for brain injury in term newborns. In: Clinical Trials.gov. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US). 2000 – NLM Identifier: NCT01649648 [cited 2013 Sep 03].