Влияние мезенхимных стволовых клеток на аллерген-специфические реакции лейкоцитов при атопической гиперчувствительности

А. А. Айзенштадт¹ ² *, О. В. Супильникова¹, В. В. Багаева¹, А. Б. Смолянинов¹ ², М. П. Самойлович³, В. Б. Климович³

1. ООО «Покровский банк стволовых клеток»
2. Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова
3. Российский научный центр радиологии и хирургических технологий, Санкт-Петербург
4. * электронный адрес: aizendt@gmail.com

   Из образцов венозной крови 16 доноров-добровольцев, в анамнезе которых были зафиксированы клинические проявления атопической гиперчувствительности, выделяли лейкоцитарную фракцию, содержащую лимфоциты, моноциты и гранулоциты. При культивировании в присутствии соответствующих аллергенов содержание В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов и естественных киллеров оставалось неизменным. Контакт клеток лейкоцитарных фракций с аллергенами во всех изученных пробах индуцировал продукцию IgE и IL-4. Реакция на контакт с аллергеном в 13 случаях из 16 проявлялась также в увеличении субпопуляции Т-лимфоцитов, несущих маркер поздней активации (антиген HLA-DR). Сокультивирование с мезенхимными стромальными клетками (МСК) из костного мозга, жировой ткани или пупочного канатика блокировало индуцированную аллергеном секрецию IgE и IL-4 лейкоцитами и формирование субпопуляции HLA-DR+ активированных T-лимфоцитов. Существенных различий во влиянии МСК, выделенных из трех различных источников, на аллерген-специфические реакции лейкоцитов не обнаружено. Сокультивирование клеток лейкоцитарных фракций с МСК из всех трех источников приводило к возрастанию содержания регуляторных Т-лимфоцитов в среднем на 30%. Таким образом, иммуномодулирующая активность МСК может проявляться in vitro в блокировании эффекторного звена аллергических реакций.

   Мезенхимные стволовые клетки (МСК) обладают иммуномодулирующей активностью, которая проявляется в экспериментах in vitro и in vivo. Наиболее убедительны данные, касающиеся супрессивного влияния МСК на функции Т-лимфоцитов (Glennie et al., 2005) и дендритных клеток (Chen et al., 2007). Установлено, что трансплантация МСК экспериментальным животным благоприятно сказывается на течении ряда воспалительных заболеваний аутоиммунной природы (Chen et al., 2006; Nauta et al., 2007; Nasef et al., 2008). Влияние МСК на аллергические реакции остается малоизученным. В ходе ограниченных клинических испытаний описано ослабление реакций на пищевые и ингаляционные аллергены у пациентов после трансплантации культивированных аутологичных МСК костного мозга (Гранов и др., 2005). При моделировании на мышах бронхиальной астмы установлено, что внутривенное введение сингенных МСК из костного мозга (Nemeth et al., 2010), аллогенных эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) (Ogulur et al., 2014) снижает интенсивность проявлений заболевания. Подобный позитивный эффект наблюдали также в ксеногенной системе при трансплантации сенсибилизированным мышам МСК, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (Sun et al., 2012).

   Цель настоящей работы состояла в исследовании влияния МСК, выделенных из различных тканей человека, на аллерген-специфические реакции культивируемых лейкоцитов доноров, сенсибилизированных определенными аллергенами.

Материал и методика

   В исследовании использовали образцы венозной крови 16 доноров-добровольцев, в анамнезе которых были зафиксированы клинические проявления гиперчувствительности (аллергический ринит, атопический дерматит, острая крапивница, гастроэнтерологические расстройства, атопическая бронхиальная астма, анафилаксия). В 4 случаях реакции развивались после приема пищевых продуктов, в 3 — после применения лекарственных препаратов, в остальных — после контакта с бытовыми и с пыльцевыми аллергенами (4 и 5 случаев соответственно). Все доноры в момент сбора образцов крови находились в состоянии ремиссии и не имели клинических проявлений аллергических реакций.

   Полученные образцы гепаринизированной крови наслаивали на градиент фиколла, центрифугировали и собирали лейкоцитарную фракцию, которую после отмывания суспендировали в ростовой среде RPMI с 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, Новая Зеландия) и доводили концентрацию клеток до 5 * 10⁶ в 1 мл. Клеточный состав лейкоцитарной фракции определяли с помощью гематологического анализатора Beckman-Coulter ACT Diff2.

   Состояние сенсибилизации доноров в отношении указанных в анамнезе аллергенов было подтверждено путем инкубации клеток лейкоцитарной фракции с растворами соответствующих аллергенов и последующего определения в среде культивирования концентрации иммуноглобулина Е (IgE) методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора реагентов IgE-общий (Вектор-Бест, Россия) согласно инструкции фирмы-изготовителя.

   Наряду с этим реакцию лейкоцитов на контакт с аллергеном in vitro оценивали по содержанию в культуральной среде IL-4, которое определяли методом ИФА с использованием набора ИФА-IL-4 (Вектор-Бест, Россия). В качестве контроля использовали культуры лейкоцитов без добавления аллергенов. В предварительных экспериментах было установлено, что оптимальный срок инкубации с аллергенами составляет 72 ч.

   Образцы костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика получали при наличии информированного согласия доноров. Методы выделения МСК, их культивирования и фенотипическая характеристика описаны ранее (Айзенштадт и др., 2014).

   В экспериментах по сокультивированию с лейкоцитами, стимулированными аллергенами, использовали культуры МСК 3—4 пассажей, находившиеся в фазе логарифмического роста (30—60 % конфлюэнтности). Для этого МСК рассевали в ячейки 6-луночного планшета по 30 тыс. кл./см², через 24 ч в те же ячейки вносили равное количество клеток лейкоцитарных фракций. В смешанные культуры добавляли растворы аллергенов и культивировали в среде RPMI с 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, Новая Зеландия).

   После инкубации с аллергенами в течение 72 ч клетки лейкоцитарной фракции и среду культивирования собирали раздельно. В среде определяли содержание IgE и IL-4. Фракцию клеток анализировали методом проточной цитофлуорометрии. Выявляли популяции B-лимфоцитов (CD19+), естественных киллеров (CD3- , CD16+ и CD56+), Т-лимфоцитов (CD3+), активированных Т-лимфоцитов (CD3+ и HLA-DR+), а также регуляторных Т-клеток (CD3+, CD4+ и CD127low).

   После сокультивирования с МСК из ячеек планшета удаляли среду и определяли в ней концентрации IgE и IL-4. Лейкоциты снимали с поверхности монослоя, повторно смывали 0.02%-ным раствором версена. Смывы объединяли, готовили суспензии клеток в 500 мкл ФСР и определяли в них содержание указанных выше клеточных популяций.

   Для цитофлуорометрического анализа клетки окрашивали меченными флуорохромами антителами в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре. Использовали реагенты фирмы Beckman Coulter (США). Анализ выполняли на проточном цитофлуорометре FC500 с длиной волны лазерного излучения 488 нм и программным обеспечением CXP в соответствии с инструкцией фирмы-производителя (Beckman Coulter, США).

   Все эксперименты повторяли четырехкратно. Полученные данные обрабатывали статистически с помощью программы Microsoft Exсel. Для каждой выборки определяли ошибку среднего по формуле M±σ/√n. Межгрупповые различия оценивали с помощью U-критерия Манна—Уитни.

   Использованные реактивы: культуральная среда RPMI, сыворотка эмбрионов коров, культуральная среда AdvanceSTEM mesenchymal stem cell media, заменитель сыворотки Mesenchymal Stem Cell Growth Supplement, раствор антибиотиков пенициллин—стрептомицин и фосфатно-солевой буфер (HyClone, Новая Зеландия); раствор фиколла и раствор Версена (Биолот, Россия); набор реагентов IgE-общий, набор реагентов ИФА-IL-4 и растворы аллергенов (Вектор-Бест, Россия); моноклональные антитела CD3-FITC /CD19-PE, CD3-FITC /HLA-DR-PE, CD3-FITC /CD56+16-PE, CD45-PC5, CD45-PC7, CD25-PC5, CD127-PE, CD4-FITC (Beckman Coulter, США).

Результаты

   Анализ клеточного состава лейкоцитарных фракций, выделенных из крови доноров, сенсибилизированых в отношении ряда аллергенов (см. таблицу), показал, что при выделении на ступенчатом градиенте фиколла происходило обогащение получаемой популяции клеток лимфоцитами и моноцитами. Доля клеток гранулоцитарного ряда при этом снижалась в 3—5 раз, но оставалась в пределах от 6 до 26%.

   При культивировании клеток лейкоцитарных фракций с аллергенами процентное содержание В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов и естественных киллеров в популяции оставалось неизменным (рис. 1).

   Присутствие аллергенов в среде культивирования всех 16 образцов лейкоцитарных фракций индуцировало достоверное увеличение концентраций IgE (рис. 2) и IL-4 (рис. 3).

   В 13 случаях из 16 инкубация с аллергенами приводила к росту содержания активированных (HLA-DR-позитивных) Т-лимфоцитов в 1.5—3 раза (рис. 4).

   Сокультивирование лейкоцитарных фракций с МСК блокировало индуцированные аллергенами проявления гиперчувствительности: роста концентраций IgE и IL-4 и содержания активированных Т-лимфоцитов в присутствии МСК не происходило (рис. 2—4). При этом МСК из костного мозга, жировой ткани или пупочного канатика блокировали как генерацию активированных Т-лимфоцитов, так и продукцию IgE и IL-4 с одинаковой эффективностью.

   Инкубация с аллергенами не приводила к значимому увеличению доли регуляторных Т-лимфоцитов ни в одном из исследованных образцов (рис. 5).

   Сокультивирование лейкоцитарных фракций с МСК из костного мозга и жировой ткани или пупочного канатика приводило к статистически значимому увеличению относительного содержания регуляторных Т-клеток (CD4+CD25+CD127low). В среднем при сокультивировании с МСК пупочного канатика относительное содержание регуляторных Т-клеток увеличивалось на 34% (минимальное значение — 13, максимальное — 59%). В опытах с МСК из костного мозга прирост этого показателя составлял 31% (минимальное значение — 13, максимальное — 53%), а при использовании МСК жировой ткани — 30% (минимальное значение — 14, максимальное — 48%). Достоверных различий в степени влияния МСК из разных источников на увеличение содержания регуляторных Т-клеток обнаружено не было.

   Рисунок 1. Содержание В-лимфоцитов флц), T-лимфоцитов (Глц) и естественных киллеров (ЕК) относительно общего количества лимфоцитов в лейкоцитарных фракциях после их культивирования в ростовой среде (контр) или в среде с аллергенами. Вертикальные отрезки — ошибки среднего. Клетки лейкоцитарной фракции культивировали в присутствии аллергена.

   Рисунок 2. Концентрация IgE в среде после культивирования клеток лейкоцитарных фракций в ростовой среде (контроль), или в среде с аллергенами (аллерген), или при сокультивировании с МСК из разных источников в присутствии аллергенов. Клетки лейкоцитарной фракции культивировали в присутствии аллергена совместно с МСК костного мозга (алл+МСК КМ), МСК жировой ткани (алл+МСК ЖТ) или МСК пупочного канатика (алл+МСК ПК). Звездочкой обозначены данные, достоверно отличные от контроля (Р < 0.05).

   Рисунок 3. Концентрация IL-4 в среде после культивирования клеток лейкоцитарных фракций в ростовой среде (контроль), или в среде с аллергенами (аллерген), или при сокультивировании с МСК из разных источников в присутствии аллергенов. Обозначения те же, что и на рис. 2.

   Рисунок 4. Содержание активированных (CD3+ и HLA-DR+) Т-лимфоцитов (Такт) относительно количества CD3+-лимфоцитов после культивирования клеток лейкоцитарных фракций в ростовой среде (контроль), или в среде с аллергенами (аллерген), или при сокультивировании с МСК из различных источников в присутствии аллергенов. Обозначения те же, что и на рис. 2.

   Рисунок 5. Содержание регуляторных Т-лимфоцитов (Трег) (CD4+, CD25+ и CD127low) относительно количества CD3+-лимфоцитов после культивирования клеток лейкоцитарных фракций в ростовой среде (контроль), или в среде с аллергенами (аллерген), или при сокультивировании с МСК из различных источников в присутствии аллергенов. Звездочками с горизонтальными отрезками обозначены данные, достоверно отличные от контроля (Р < 0.05).

Обсуждение

   В настоящей работе моделировали одно из звеньев эффекторной фазы аллергических реакций, а именно изменение состояния культивируемых клеток сенсибилизированного организма при повторном контакте с аллергеном.

   Рецепция аллергена обеспечивается в этом случае специфическими антителами класса IgE, которые либо встроены в мембраны В-лимфоцитов в виде В-клеточного IgE-рецептора (Wu etal., 2014), либо фиксированы на поверхности эозинофилов, базофилов или тучных клеток посредством высокоаффинного Fc-рецептора (Stone et al., 2010). В-лимфоциты отвечают на связывание аллергена продукцией IgE, а клетки гранулоцитарного ряда — синтезом IL-4, который в свою очередь стимулирует формирование субпопуляции активированных Т-лимфоцитов.

   Согласно общепринятому представлению, при разделении клеток периферической крови на фиколле лимфоциты и моноциты задерживаются в верхнем слое градиента, а гранулоциты вместе с эритроцитами оказываются в нижней фракции (Noble etal., 1968). Анализ клеточного состава лейкоцитарных фракций, полученных в настоящей работе, показал, что в выделенных популяциях наряду с лимфоцитами присутствовали моноциты и гранулоциты, т. е. все клеточные типы, которые ответственны за появление сдвигов, наблюдаемых при культивировании в присутствии аллергенов.

   В трех образцах (№ 6, 7 и 10) реакции лейкоцитов на внесение в культуру аллергена проявлялись в появлении в культуральной среде IgE и IL-4, но роста численности активированных Т-лимфоцитов в этих пробах не было. Возможно, что в указанных случаях темп дифференцировки был замедлен, и накопления клеток к моменту прекращения культивирования не произошло.

   Следует отметить, что группа обследованных доноров была достаточно гетерогенной по типу сенсибилизирующего аллергена, формам и тяжести клинических проявлений атопической гиперчувствительности. Тем не менее, в целом реакции клеток лейкоцитарной фракции на контакт с аллергенами были достаточно однородными: во всех случаях при контакте с аллергенами наблюдали продукцию IgE и IL-4, в большинстве опытов происходил рост численности популяции активированных Т-клеток.

   Проявления иммуномодулирующей активности МСК в отношении лейкоцитов доноров-аллергиков также оказались однозначными. В ходе экспериментов было установлено, что аллогенные МСК блокировали инициированную инкубацией с аллергенами продукцию IgE и IL-4 и предотвращали увеличение относительного содержания Т-лимфоцитов, несущих маркер поздней активации HLA-DR. Полученные результаты согласуются со сложившимся в литературе представлением о том, что блокада активации Т-лимфоцитов является одним из основных проявлений иммуномодулирующей активности МСК (Le Blanc et al., 2004; Cappellesso-Fleury et al., 2010; Kron-steiner etal., 2011). Увеличение экспрессии маркеров активации лимфоцитов (CD25, CD71 и HLA-DR) рассматривают как один из показателей обострения атопических заболеваний, причем уровень экспрессии HLA-DR связывают с тяжестью заболевания (Gemou-Engesaeth et al., 2002; Antunez et al., 2006).

   Сокультивироваие клеток лейкоцитарных фракций с МСК из разных источников приводило к росту количества регуляторных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+ CD25+ CD127low, в то время как само присутствие аллергена в лейкоцитарных культурах влияния на их численность не оказывало. Формирование популяции Т-регуляторных клеток под влиянием МСК описано в ряде работ. Согласно современным представлениям, снижение количества и (или) функциональной активности регуляторных Т-клеток может влиять на развитие аллергической патологии. Как известно, регуляторные Т-клетки участвуют в поддержании баланса между Th1- и Th2-типами иммунного ответа. При этом снижение функциональной активности регуляторных Т-клеток может быть компенсировано увеличением их численности (Zhang etal., 2014).

   В ряде исследований ранее было показано, что МСК из разных источников могут различаться по свойствам, в том числе по силе и направленности иммуномодулирующей активности (Wagnera et al., 2005; Айзенштадт и др., 2014). Данные, полученные в настоящей работе, свидетельствуют об отсутствии различий между МСК, полученными из костного мозга, жировой ткани или пупочного канатика, в способности ингибировать проявления аллерген-специфических эффекторных реакций в условиях in vitro.

Список литературы

• Айзенштадт А. А., Иванова Н. А., Багаева В. В., Смолянинов А.Б., Пиневич А. А., Самойлович М. П., Климович В. Б. 2014. Внутриклеточные иммуноглобулины в линиях Namalva и U266 при сокультивировании с мезенхимными стромальными клетками. Цитология. 56 (2) : 117—122. (Ayzenshtadt A. A., Ivanova N. A., Bagaeva V. V., Smolyaninov A. B., Pinevich A. A., Samoylovich M. P., Klimovich V. B. 2014. Intracellular immunoglobulins in Namalva and U266 cells cocultivated with mesenchymal stromal cells. Cell Tissue Biol. 8 (3) : 193—197.)
• Гранов А. М., Жаринов Г. М., Зверев О. Г., Некрасова Н. Ю., Агафонова М. В., Климович В. Б. 2005. Способ лечения аллергических заболеваний. Патент РФ № 2250773. (Granov A. M., Zharinov G. M., Zverev O. G., Neklasova N. Y., Agafonova M. V., Klimovich V. B. 2005. A method for treating allergic diseases. RF patent N 2250773.)
• Antunez C., Torres M. J., Mayorga C., Corzo J. L., Jurado A., Santamaria-Babi L. F., Vera A., Blanca M. 2006. Cytokine production, activation marker, and skin homing receptor in children with atopic dermatitis and bronchial asthma. Pediatr. Allergy Immunol. 17 : 166—174.
• Cappellesso-Fleury S., Puissant-Lubrano B., Apoil P. A., Titeux M., Winterton P., Casteilla L., Bourin P., Blancher A. 2010. Human fibroblasts share immunosuppressive properties with bone marrow mesenchymal stem cells. J. Clin. Immunol. 30 : 607—619.
• Chen L., Zhang W., Yue H., Han Q., Chen B., Shi M., Li J., Li B., You S., Shi Y., Zhao R. C. 2007. Effects of human mesenchymal stem cells on the differentiation of dendritic cells from CD34+ cells. Stem Cells Develop. 16 : 719—731.
• Chen X., Armstrong M. A., Li G. 2006. Mesenchymal stem cells in immunoregulation. Immunol. Cell Biol. 84 : 413—421.
• Gemou-Engesaeth V., Masao Toda M. K., Hamid Q., Halvorsen S., Groegaard J. B., Corrigan C. J. 2002. Expression of activation markers and cytokine mRNA by peripheral blood CD4 and CD8 T cells in atopic and nonatopic childhood asthma: effect of inhaled glucocorticoid. Therapy Pediatrics. 109 : 1—9.
• Glennie S., Soeiro I., Dyson P. J., Lam E. W., Dazzi F. 2005. Bone marrow mesenchymal stem cells induce division arrest energy of activated T-cells. Blood. 105 : 2821—2827.
• Kronsteiner B., Wolbank S., Peterbauer A., Hackl C., Redl H., van Griensven M., Gabriel C. 2011. Human mesenchymal stem cells from adipose tissue and amnion influence T-cells depending on stimulation method and presence of other immune cells. Stem Cells Develop. 20 : 2115—2126.
• Le Blanc K., Rasmusson I., SundbergB., Gotherstrom C., Hassan M., Uzunel M., Ringden O. 2004. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet. 363 : 1439—1441.
• Nasef A., Ashammakhi N., Fouillard L. 2008. Immunomodulatory effect of mesenchymal stromal cells: possible mechanisms. Regen. Med. 3 : 531—546.
• Nauta A. J., Fibbe W. E. 2007. Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells. Blood. 110 : 3499—3506.
• Nemeth K., Keane-Myers A., Brown J. M., Metcalfe D. D., Gorham J. D., Bundoc V. G., Hodges M. G., Jelinek I., Madala S., Karpati S., Mezey E. 2010. Bone marrow stromal cells use TGF-beta to suppress allergic responses in a mouse model of ragweed-in-duced asthma. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 107 : 5652—5657.
• Noble P. B., Cutts J. H., Carroll K. K. 1968. Ficoll flotation for the separation of blood leukocyte types. Blood. 31 : 66—73.
• Ogulur I., Gurhan G., Kombak F. E., Filinte D., Barlan I., Akkoc T. 2014. Allogeneic pluripotent stem cells suppress airway inflammation in murine model of acute asthma. Int. Immunopharmacol. 22 : 31—40.
• Stone K. D., Prussin C., Metcalfe D. D. 2010. IgE, mast cells, basophils, and eosinophils. J. Allergy Clin. Immunol. 125 : 73—80.
• Sun Y. Q., Deng M. X., HeJ., Zeng Q. X., Wen W., Wong D. S., Tse H. F., Xu G., Lian Q., Shi J., Fu Q.L. 2012. Human pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells prevent allergic airway inflammation in mice. Stem Cells. 30 : 2692—2699.
• Wagnera W., WeinaF., Seckingera A., Frankhauserb M., Wirknerc U., Krausea U., Blakec J., Schwagerc C., Ecksteina V., Ansorgec W., Hoa A. D. 2005. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. Exp. Hematol. 33 : 1402—1416.
• Wu L. C., Zarrin A. A. 2014. The production and regulation of IgE by the immune system. Nat. Rev. Immunol. 4 : 247—259.
• Zhang H., Kong H., Zeng X., Guo L., Sun X., He S. 2014. Subsets of regulatory T-cells and their roles in allergy. J. Translational Med. 12 : 125—128.