Обработка (выделение стволовых клеток, каким образом происходит)

   Выделение осуществляется в специальном помещении, оснащенном системой подачи стерильного воздуха и с применением одноразовых расходных материалов.

   Выделение мезенхимальных стволовых клеток осуществляют в ходе этапа собственно выделения клеток, этапа культивирования и этапа криоконсервации.

1. Выделение клеток

   В ходе этапа выделения клеток последовательно осуществляют следующие процедуры:

• промывают пупочную вену раствором Версена;
• концы пупочного канатика зажимают специальными клеммами и заполняют пупочную вену раствором ферментов;
• промывают пупочную вену фосфатно-солевым буфером, после чего полученный смыв с помощью центрифугирования отмывают от раствора ферментов;
• полученный после центрифугирования концентрат клеток высевают на стерильные культуральные флаконы для проведения отбора мезенхимальных стволовых клеток.

2. Культивирование

   После получения первичного концентрата клеток проводят этап культивирования. Для этого через 3-5 суток после этапа выделения, флаконы с клетками промывают культуральной средой для удаления неприкрепившихся клеток. После того, как 70% поверхности флакона будет покрыто распластанными клетками, проводят перенос мезенхимальных стволовых клеток с каждого флакона на 2 новых.

   Этап культивирования необходим для получения чистой культуры МСК, поскольку в ходе данного этапа осуществляется их селекция на основе способности МСК прикрепляться к культуральному пластику. Кроме того, этап культивирования необходим для получения количества клеток, пригодного для криоконсервации. Поскольку при слишком низкой концентрации клеток значительно ухудшается их жизнеспособность при замораживании.

3. Криоконсервация

   После того, как 70-80% поверхности новых флаконов также будет покрыто МСК (т.е. численность МСК составит не менее 1 млн с 1 флакона), осуществляют этап криоконсервации. Для этого клетки переносят в пробирки, отмывают от культуральной среды и добавляют криопротектор ДМСО (диметилсульфоксид). Это вещество, связывающее воду для предотвращения образования кристаллов льда при низких температурах. Это давно используемый криопротектор, его добавляют аккуратно по капле в течение 12 минут при температуре +4. Каждую пробирку маркируют индивидуальным номером и штрихкодом, а также ФИО матери.

   Подготовленные таким образом пробирки передают в лабораторию криогенного хранения для осуществления криоконсервации. Криоконсервация - процесс криогенной подготовки биологического образца для длительного хранения биопрепаратов при температурах ниже -190°C. Технологический цикл криоконсервации состоит их трех основных этапов: подготовка к замораживанию (охлаждение от +20ºС до +1ºС на аппарате Coolmix (Biosafe), затем замораживание от +1 ºС до -100ºС в аппарате Planer (Великобритания), и завершающий этап – хранение (в жидком азоте при температуре -196ºС).

   Замораживание культур мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика проводится с помощью программных замораживателей Planer (Великобритания). Образцы помещаются в камеру программного замораживателя, где парами азота они замораживаются до температуры -100ºС в течение полутора часов. Для наиболее эффективной криоконсервации образцов были разработаны и оптимизированы программы замораживания, т.е. те скорости понижения температуры, которые исключают повреждение клеток образующимися кристаллами льда. Таким образом, нами используется программа заморозки с темпом замораживания от 1ºС до 3ºС/мин, при этом данный протокол позволяет «обходить» точку кристаллизации, и, соответственно, исключает повреждение клеток.

   После замораживания образцы перекладываются в криохранилище, где хранятся в жидком азоте при температуре -196ºС.